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猪圆环病毒PCR检测试剂盒

发布时间:2014-01-23 14:10:53

用途

猪圆环病毒(PCV)聚合酶链式反应(PCR)检测试剂盒,用于检测疑似感染动物的血清或组织中的PCV,适用于PCV的检测、诊断和流行病学调查。

原理

利用离心柱内硅基质膜提取DNA,以此为模板,在特异性引物和TaqDNA聚合酶的作用下,经高温变性、低温退火、中温延伸的循环,使特异 DNA片段拷贝数放大一倍。经35次循环,最终使扩增 DNA片段放大数百万倍。将扩增 DNA片段进行电泳,经染色后,在紫外灯照射下,肉眼可见到 DNA片段的扩增带。

试剂盒组成

名称

组分

10头份

20头份

贮藏条件

A

(核酸提取)

吸附柱(Spin Column

10(支)

20(支)

室温

12个月

2ml收集管(Collection Tube

20(支)

40(支)

试剂Ⅰ(Reagent Ⅰ)

2.4ml

4.4ml

试剂Ⅱ(Reagent Ⅱ)

800μl

1.6ml

异丙醇(Isopropanol

5mL

8ml

洗液Ⅰ*Rinse Ⅰ)

3.5ml

7ml

洗液Ⅱ*Rinse Ⅱ)

3ml

6ml

洗脱液(Elution Buffer

600μl

1.1ml

B

PCR检测)

阳性对照(Positive Control

600μl

1ml

-20

6个月

阴性对照(Negative Control

600μl

1ml

PCR反应液(PCR reaction solution

242μl

484μl

*洗液Ⅰ首次使用前,请添加2.5ml10头份)/5ml20头份)100%乙醇。

*洗液Ⅱ首次使用前,请添加7ml10头份)/14ml20头份)100%乙醇。

需要自备的器材及试剂

    器材: PCR扩增仪、电泳系统、紫外凝胶成像仪、可调移液器(2.5µl10µl200µl1000µl)、离心机、微波炉、一次性DNase Free吸头(10µl200µl1000µl)、DNase Free 1.5ml离心管、0.2mlPCR管。

试剂:琼脂糖、Marker、核酸染色液、TAE电泳缓冲液、PBS液(0.01M,pH7.2-7.4)。

使用注意事项

所有接触病料的物品均应合理处理,以免造成人员伤害及污染实验室。

所有试剂应在规定的温度储藏,-20℃保存的各试剂使用前应放于室温完全融化,使用后立即放回-20℃。

严格遵守操作说明可以获得良好的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。

反复冻融试剂将减低检测灵敏度,建议在3次内用完,请严格按照试剂盒说明书操作。

样品制备

       1样品采集:病死或扑杀的猪,取肺、淋巴结、脾脏等组织;待检活猪,用注射器取血5 ml28 ℃保存。(要求送检病料新鲜,严禁反复冻融。)

        2样品处理:每份样品分别处理。

 2.1组织样品处理:每份组织分别从三个不同位置称取样品约3g,用手术剪剪碎混匀后,按照1:4加入PBS液于研磨器中研磨,匀浆后48000×g离心2min,取上清液200µl1.5ml灭菌离心管(自备)中。

 2.2全血样品处理:待血凝后取血清放于离心管中,8000×g离心5 min,取上清液200µl,置1.5ml灭菌离心管(自备)中。

        2.3阳性对照处理:取阳性对照200µl,置1.5ml灭菌离心管(自备)中。

        2.4阴性对照处理:取阴性对照200µl,置1.5ml灭菌离心管(自备)中。

 操作步骤

       1 病毒 DNA提取

       1.1 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照,分别加入200µl试剂Ⅰ,剧烈震荡混匀,室温放置3-5min

       1.2 加入75µl试剂Ⅱ,混合均匀后,4 12000×g离心3-5 min

       1.3 将上清液转移到新的2ml 收集管中,加入300µl异丙醇,上下颠倒混匀。

    1.4 将混匀液转移至吸附柱中(提前将吸附柱安置于另一新的2ml 收集管中),4 12000×g离心1 min,弃滤液。注:若吸附柱中有液体残留,可重复离心1 min

       1.5 加入500µl洗液Ⅰ至吸附柱中,室温静置1 min4 12000×g离心1 min,弃滤液。

    注:请确认洗液中已经加入了指定体积的100%乙醇。

    1.6 加入800µl洗液Ⅱ至吸附柱中,4 12000×g离心1 min,弃滤液。将吸附柱放回收集管中,4 12000×g离心1 min注:请确认洗液中已经加入了指定体积的100%乙醇。

    1.7 将吸附柱安置于新的1.5ml的离心管(自备)中,在吸附柱膜的中央处加入50µl洗脱液,室温静置3min4 12000×g离心1 min洗脱病毒DNA注:溶解的DNA应置于-20℃保存。

        2 PCR操作程序

    25µl体系:使用前每份中分别加入22µl PCR反应液和3µl 1.7”中提取的模板DNA(注:使用时可根据情况适当稀释),混匀后按照以下程序进行PCR扩增:。

95    3min

95    30s

55    40s      35个循环

72    50s    

72    10min

        3 电泳

2g琼脂糖于250ml锥形瓶中,加入TAE电泳缓冲液200ml,于微波炉中熔解,再加入10µl核酸染色液混匀。在电泳槽内放好梳子,倒入琼脂糖凝胶,待凝固后将PCR扩增产物10µlMarker适量点样于琼脂糖凝胶孔中,以110-120V电压于TAE电泳缓冲液中电泳30min,紫外灯下观察结果。

结果判定

阳性对照在440bp处出现扩增带、阴性对照无带出现(引物带除外)时,实验结果成立。被检样品在在440bp处出现扩增带为猪圆环病毒阳性,否则为阴性。

附:本试剂盒A盒中附赠的TAE电泳缓冲液,使用时用双蒸水或去离子水50倍稀释后使用。

 


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