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猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测试剂盒

发布时间:2014-01-23 11:46:40

用途

猪流行性腹泻病毒(PEDV反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测试剂盒,用于检测疑似感染动物组织中的PEDV,适用于PEDV的检测、诊断和流行病学调查。

原理

利用离心柱内硅基质膜提取RNA,在反转录酶的作用下,以 RNA为模板,引物为起点合成与RNA模板互补的cDNA链。在 TaqDNA聚合酶的作用下,经高温变性、低温退火、中温延伸的循环,使特异DNA片段的拷贝数放大一倍。经过 35次循环,最终使扩增 DNA片段放大了数百万倍。将扩增DNA片段进行电泳,经染色后,在紫外灯照下,肉眼可见到 DNA片段的扩增带。

试剂盒组成

名称

组分

10头份

20头份

贮藏条件

A

(核酸提取)

吸附柱(Spin Column

10(支)

20(支)

室温

12个月

2ml收集管(Collection Tube

20(支)

40(支)

试剂Ⅰ(Reagent Ⅰ)

2.4ml

4.4ml

试剂Ⅱ(Reagent Ⅱ)

800μl

1.6ml

异丙醇(Isopropanol

5mL

8ml

洗液Ⅰ* Rinse Ⅰ)

3.5ml

7ml

洗液Ⅱ* Rinse Ⅱ)

3ml

6ml

洗脱液(Elution Buffer

600μl

1.1ml

B

RT-PCR检测)

阳性对照(Positive Control

600μl

1ml

-20

6个月

阴性对照(Negative Control

600μl

1ml

RT-PCR反应液  RT-PCR reaction solution

231μl

462μl

酶混合液(Mixture enzyme

11μl

22μl

*洗液Ⅰ(Rinse Ⅰ)首次使用前,请添加2.5ml10头份)/5ml20头份)100%乙醇。

*洗液Ⅱ(Rinse Ⅱ)首次使用前,请添加7ml10头份)/14ml20头份)100%乙醇。

需要自备的器材及试剂

器材:PCR扩增仪、电泳系统、紫外凝胶成像仪、可调移液器(2.5µl10µl200µl1000µl)、离心机、微波炉、一次性RNase Free吸头(10µl200µl1000µl)、RNase Free 1.5ml离心管、0.2mlPCR管。

试剂:琼脂糖、Marker、核酸染色液、TAE电泳缓冲液、PBS液(0.01M,pH7.2-7.4)。

使用注意事项

所有接触病料的物品均应合理处理,以免造成人员伤害及污染实验室。

所有试剂应在规定的温度储藏,-20保存的各试剂使用前应放于室温完全融化,使用后立即放回-20

严格遵守操作说明可以获得良好的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。

反复冻融试剂将减低检测灵敏度,建议在3次内用完,请严格按照试剂盒说明书操作。

样品制备

       1 样品采集:病死或扑杀的猪,取小肠及内容物;待检活猪,取粪便适量。28℃保存,送实验室检测。(要求送检病料新鲜,严禁反复冻融。)

       2 样品处理:每份样品分别处理。

      2.1 小肠及内容物样品处理:取50px肠管,剪碎,按照1:4加入PBS液于研磨器中研磨,匀浆后于48000×g离心2min,取上清液200µl1.5ml灭菌离心管(自备)中。

   2.2 粪便样品处理:用PBS液以1:4稀释后,漩涡混匀,混合物于4 8000×g离心15min,收集上清液,立即提取RNA

      2.3 阳性对照处理:取阳性对照200µl,置1.5ml灭菌离心管(自备)中。

      2.4 阴性对照处理:取阴性对照200µl,置1.5ml灭菌离心管(自备)中。

操作步骤

       1  病毒 RNA提取

       1.1 取已处理的样品、阳性对照和阴性对照,分别加入200µl试剂Ⅰ,剧烈震荡混匀,室温放置3-5min

       1.2 加入75µl 试剂Ⅱ,混合均匀后,4 12000×g离心3-5 min

       1.3 将上清液转移到新的2ml收集管中,加入300µl异丙醇,上下颠倒混匀。

       1.4 将混匀液转移至吸附柱中(提前将吸附柱安置于另一新的2ml收集管中),4 12000×g离心1 min,弃滤液。注:若吸附柱中有液体残留,可重复离心1 min

    1.5 加入500µl洗液Ⅰ至吸附柱中, 4 12000×g离心1 min,弃滤液。

    注:请确认洗液中已经加入了指定体积的100%乙醇。

    1.6 加入800µl洗液Ⅱ至吸附柱中,4 12000×g离心1 min,弃滤液。将吸附柱放回2ml收集管中,4 12000×g离心1 min注:请确认洗液已经加入了指定体积的100%乙醇。

    1.7 将吸附柱安置于新的1.5ml的离心管(自备)中,在吸附柱膜的中央处加入50µl洗脱液,室温静置3min4 12000×g离心1 min洗脱病毒RNA注:溶解的RNA应置于-20或者更低温度环境下保存。

        2 RT-PCR操作程序

        25µl体系: 使用前每份中分别加入21µl RT-PCR反应液、1µl酶混合液和3µl1.7”中提取的模板RNA(注:使用时可根据情况适当稀释),混匀后按照以下程序进行PCR扩增:

50    30min

95℃    2min

95℃    40s

55℃    40s      35个循环

72    50s     

72℃    10min

       3 电泳

   2g琼脂糖于250ml锥形瓶中,加入TAE电泳缓冲液200ml,于微波炉中熔解,再加入10µl核酸染色液混匀。在电泳槽内放好梳子,倒入琼脂糖凝胶,待凝固后将PCR扩增产物10µlMarker适量点样于琼脂糖凝胶孔中,以110-120V电压于TAE电泳缓冲液中电泳30min,紫外灯下观察结果。

    结果判定

阳性对照在800bp处出现扩增带、阴性对照无带出现(引物带除外)时,实验结果成立。被检样品在在800bp处出现扩增带为猪流行性腹泻病毒阳性,否则为阴性。

 附:本试剂盒A盒中附赠的TAE电泳缓冲液,使用时用双蒸水或去离子水50倍稀释后使用。

 

 

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